Реакция непрямой или пассивной гемагглютинации (рпга). Реакция гемагглютинации это Рнга микробиология

Реакция агглютинации - РА (от лат. aggluti- natio - склеивание) - простая по постановке реакция, при которой происходит связыва­ние антителами корпускулярных антигенов (бактерий, эритроцитов или других клеток, нерастворимых частиц с адсорбированными на них антигенами, а также макромолекуляр- ных агрегатов). Она протекает при наличии электролитов, например при добавлении изо­тонического раствора натрия хлорида.

Применяются различные варианты реакции агглютинации: развернутая, ориентировоч­ная, непрямая и др. Реакция агглютинации проявляется образованием хлопьев или осад­ка

РА используют для:

определения антител в сыворотке крови боль­ных, например, при бруцеллезе (реакции Райта, Хеддельсона), брюшном тифе и паратифах (реак­ция Видаля) и других инфекционных болезнях;

определения возбудителя, выделенного от больного;

определения групп крови с использова­нием моноклональных антител против алло- антигенов эритроцитов.

Для определения у больного антителставят развернутую реакцию агглютинации: к разве­дениям сыворотки крови больного добавля­ют диагностикум (взвесь убитых микробов,) и через несколько часов инкубации при 37 °С отмечают наибольшее разведение сыворотки (титр сыворотки), при котором произошла агглютинация, т. е. образовался осадок.

Характер и скорость агглютинации зави­сят от вида антигена и антител. Примером являются особенности взаимодействия диа- гностикумов (О- и Я-антигенов) со специ­фическими антителами. Реакция агглютина­ции с О-диагностикумом (бактерии, убитые нагреванием, сохранившие термостабильный О-антиген) происходит в виде мелкозернис­той агглютинации. Реакция агглютинации с Н-диагностикумом (бактерии, убитые фор­малином, сохранившие термолабильный жгу­тиковый Н-антиген) - крупнохлопчатая и протекает быстрее.

Если необходимо определить возбудитель, выделенный от больного, ставят ориентиро­вочную реакцию агглютинации, применяя диа­гностические антитела (агглютинирующую сыворотку), т. е. проводят серотипирование возбудителя. Ориентировочную реакцию проводят на предметном стекле. К капле диа­гностической агглютинирующей сыворотки в разведении 1:10 или 1:20 добавляют чистую культуру возбудителя, выделенного от больно­го. Рядом ставят контроль: вместо сыворотки наносят каплю раствора натрия хлорида. При появлении в капле с сывороткой и микроба­ми хлопьевидного осадка ставят развернутую реакцию агглютинации в пробирках с увели­чивающимися разведениями агглютинирую­щей сыворотки, к которым добавляют по 2-3 капли взвеси возбудителя. Агглютинацию учитывают по количеству осадка и степени просветления жидкости. Реакцию считают положительной, если агглютинация отмеча­ется в разведении, близком к титру диагнос­тической сыворотки. Одновременно учитыва­ют контроли: сыворотка, разведенная изото­ническим раствором натрия хлорида, должна быть прозрачной, взвесь микробов в том же растворе - равномерно мутной, без осадка.

Разные родственные бактерии могут агглю­тинироваться одной и той же диагностической агглютинирующей сывороткой, что затрудня­ет их идентификацию. Поэтому пользуются адсорбированными агглютинирующими сыво­ротками, из которых удалены перекрестно реагирующие антитела путем адсорбции их родственными бактериями. В таких сыво­ротках сохраняются антитела, специфичные только к данной бактерии. Получение таким:^особом монорецепторных диагностических агглютинирующих сывороток было предло­жено А. Кастелляни (1902).

Реакция непрямой (пассивной) гемагглюти­нации (РНГА, РПГА) основана на использо­вании эритроцитов с адсорбированными на ■х поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови бальных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка (рис. 13.2). При отрицательной реакции эритроциты оседают ■ виде «пуговки». Обычно в РНГА выявляют антитела с помощью антигенного эритроцитарного диагностикума, который представ­ляет собой эритроциты с адсорбированными на них антигенами. Иногда применяют анти- -ельные эритроцитарные диагностику мы, на которых адсорбированы антитела. Например, можно обнаружить ботулинический токсин, добавляя к нему эритроцитарный антитель­ный ботулинический диагностикум (такую реакцию называют реакцией обратной непря­мой гемагглютинации - РОНГА). РНГА при­меняют для диагностики инфекционных бо­лезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в не­которых других случаях.

РЕАКЦИЯ КУМБСА

(Coombs test) - метод определения резус-антител на поверхности эритроцитов, которые вызывают осаждение глобулинов в сыворотке крови. Данный тест используется для диагностики гемолитической анемии у младенцев с резус-несовместимостью, у которых наблюдается разрушение эритроцитов.

Реакция коагглютинации . Клетки возбуди­теля определяют с помощью стафилококков, предварительно обработанных иммунной диагностической сывороткой. Стафилококки, содержащие белок А, имеющий сродство к Fc-фрагменту иммуноглобулинов, неспеци­фически адсорбируют антимикробные анти­тела, которые затем взаимодействуют актив­ными центрами с соответствующими микро­бами, выделенными от больных. В результате коагглютинации образуются хлопья, состо­ящие из стафилококков, антител диагности­ческой сыворотки и определяемого микроба.

Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) основана на блокаде, подавлении ан­тигенов вирусов антителами иммунной сы­воротки, в результате чего вирусы теряют свойство агглютинировать эритроциты (рис. 13.3). РТГА применяют для диагностики мно­гих вирусных болезней, возбудители которых (вирусы гриппа, кори, краснухи, клещево­го энцефалита и др.) могут агглютинировать эритроциты различных животных.

1. В Индию прибыла группа врачей по линии ВОЗ для выявления больных полиомиелитом и оказания помощи в проведении поголовной вакцинации против полиомиелита. В одной из обследованных деревень к врачам принесли из многодетной семьи мальчика 6 лет, который заболел 5 дней назад. Внезапно повысилась температура, сильно заболела голова, была повторная рвота, боль в руках и ногах. При осмотре: высокая температура, резкая слабость, менингиальные симптомы, на правой ноге снижен мышечный тонус, резко ослаблены сухожильные рефлексы, стопа свисает. При пункции спинномозгового канала цереброспинальная жидкость вытекала под повышенным давлением, увеличено количество лимфоцитов, бактерии не выделены. Поставлен предварительный диагноз «паралитическая форма полиомиелита». Каким путем мог заразиться мальчик? Как проводится специфическая активная профилактика полиомиелита? Существует ли опасность заражения других детей этой семьи, что необходимо предпринять?

Ответ: Мальчик мог заразиться фекально-оральным путем через пищу, воду, а также воздушно-капельным путем. Основной мерой профилактики полиомиелита является иммунизация живой культуральной вакциной из 3-х серотипов штаммов Сэбина В России применяется прививка от полиомиелита для перорального введения производства института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова. Прививка представляет собой трехвалентный препарат из аттенуированных штаммов Сэбина вируса полиомиелита типов 1, 2, 3, полученных на первичной культуре клеток почек африканских зеленых мартышек. . Плановым прививкам от полиомиелита подлежат дети в возрасте от 3 мес до 6 лет. Прививки оральной полиомиелитной вакциной проводятся по 2 или 4 капли вакцины внутрь троекратно в 3, 4, 5 и 6 мес с трехкратной ревакцинацией в 18, 20 мес и 14 лет. Больного мальчика необходимо поместить в стационар, а всем остальным детям этой семьи необходимо провести вакцинацию живой полиомиелитной вакциной.

1. Состав и применение вакцины гриппозной тривалентной полимерно-субъединичная жидкой (гриппол)

Это молекулярная вакцина. Состав: поверхностный АГ вируса гриппа трех подтипов(А/H1N1, A/H3N2,B). Применение: для профилактики гриппа

Экзаменационный билет №23

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Использование сорбированных диагностических препаратов основано на постоянно реализуемом в природе принципе иммунологического распознавания поверхностных структур. С этой точки зрения нет принципиальных различий между использованием, например, микробной клетки или искусственного носителя, нагруженных антигеном (антителами). В качестве основы сорбированных препаратов применяются различные носители - микробные клетки, эритроциты, латекс, бентонин, холестерин, сефадекс, дерматол, активированный уголь, споры грибов и т.д.

После работ А.Т.Кравченко (1945) наибольшее распространение в качестве носителя антигена или антител получили лишенные жизнеспособности и фиксированные различными химическими реагентами эритроциты. На принципе использования в качестве носителя антигена эритроцитов (как нативных, так и фиксированных) широкое распространение получила реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Предложение об использовании реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) в диагностических целях возникли на базе предварительно развитых знаний о высокой сорбиционной активности эритроцитов. По сравнению со многими другими носителями антигенов и антител в реакции непрямой гемагглютинации эритроциты имеют определенные преимущества. Во-первых, в изотонических солевых растворах они образуют довольно стойкое сцепление и не оседают за короткое время. Во-вторых, эритроциты одного и того же вида животных одинаковы по размеру. И, наконец, эритроциты сравнительно легко непосредственно или в результате специальной обработки присоединяют различные серологически активные компоненты.

Создание эритроцитарных диагностикумов из стабилизированных эритроцитов позволяет преодолеть те трудности, которые возникают при использовании нативных эритроцитов.

При исследовании эритроцитов, обработанных различными фиксирующими веществами, установлены некоторые их общие свойства:

По морфологии они практически не отличаются от свежих;

Не гемолизируются в гипотонических растворах, в воде и после замораживания-оттаивания;

Могут быть лиофильно высушены;

Их поверхностные структуры сохраняют способность химически модифицироваться (например, танином, диазосоединениями) и вступать в реакцию с антигенами и антителами.

Главный критерий качества фиксированных эритроцитов - возможность их использования для получения сенсибилизированных препаратов при отсутствии неспецифического склеивания в стабилизирующих жидкостях.

Подготовка поверхности эритроцитов с целью повышения сорбиционной способности к антигенам имеет важное значение при конструировании диагностических препаратов. Особенно широкое распространение получила обработка эритроцитов танином.

Под его влиянием изменяются антигенные свойства эритроцитов (проницаемость, скорость оседания), повышается их устойчивость к гемолитическому воздействию некоторых жирных кислот. Достигается, однако, главное - танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбиционной емкостью белков, что широко используется в настоящее время при изготовлении высококачественных антигенных и антительных диагностикумов.

Наряду с танизацией эритроцитов, для изготовления эритроцитарных диагностикумов и подготовки носителя антигена применяются такие химические реагенты, как бромелин, триопсин, перйодат калия, которые также модифицируют мембраны эритроцитов.

После подготовки поверхности эритроцитов идет наиболее важный процесс - процесс гемосенсибилизации - окончательный этап изготовления эритроцитарных диагностикумов.

Для упрочения связи между носителем и антигеном применяются различные конъюгирующие вещества - бисдиазобензидин, дифлуородинитробензин, хлористый циан, хлористый и уксуснокислый кадмий, хлорид брома, формальдегид, глютаровый альдегид, бромциан, риванол, амидол и др.

Использование конъюгирующих веществ способствует устранению тех недостатков, которые имеют танизированные эритроциты, применяемые для сенсибилизации без конъюгирующих веществ.

Наиболее широкое применение нашли такие конъюгирующие вещества, как хлорид хрома, глутаровый альдегид, диазоль черный С, амидол. Процесс сенсибилизации с помощью хлорида хрома происходит очень быстро - от 4 до 10 мин., чем привлекает внимание исследователей. При этом используются концентрации хлорида хрома от 0,05 до 2%, pH - не ниже 5,0 при температуре реакционной смеси 20- 250 С. В процессе сенсибилизации хлоридом хрома активизируются карбоксильные группы белков мембраны эритроцитов. В результате этого образуется ковалентная связь между мембраной эритроцитов и сенситином.

Реакция непрямой гемагглютинации обладает высокой специфичностью, поскольку склеивание эритроцитов наступает в результате взаимодействия антигена с антителами, адсорбированными на эритроцитах. Отличительной ее особенностью является высокая чувствительность: в ней выявляется 0,02-0,05 мкг белка антител. По чувствительности она значительно превосходит реакции иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, радиальной иммунодиффузии, связывания комплемента, нейтрализации. РНГА менее чувствительна, чем методы радиоиммуноэлектрофореза, определения количества белка радиоактивных антител в иммуносорбенте, иммуноферментного анализа.

К достоинствам РНГА следует отнести достаточно высокую воспроизводимость, простоту выполнения, потребность в минимальных количествах ингредиентов, особенно при использовании микрометода.

РНГА в последние годы нашла широкое применение при диагностике инфекционного ринотрахеита, диареи, аденовирусной инфекции, рота- и коронавирусной инфекции, парагриппа - 3 и респираторно – синцитиальной инфекции.

Приводим пример изготовления и применения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к рота- и коронавирусной инфекции.

Методика приготовления антительных диагностикумов для выявления рота- и коронавирусных антигенов в РНГА состоит в следующем: получение суспензии эритроцитов; фиксация их акролеинов; танизация, позволяющая получить стабильную сорбцию необходимого белка на эритроцитах; сенсибилизация танизированных эритроцитов иммуноглобулинами; определение специфичности приготовленного диагностикума. Приготовление суспензии эритроцитов осуществляется путем отбора крови клинически здорового барана в колбу со стеклянными бусами. После дефибринирования крови эритроциты должны быть отмыты 3-5 раз изотоническим (0,9%-ным) раствором натрия хлорида путем центрифугирования в течение 15-20 мин при 400g.

В целях стабилизации эритроцитов проводится их обработка акролеином. Как известно, его действие несколько мягче, чем формальдегида, и обеспечивает стабильность и более высокую активность эритроцитов. Для этого равные объемы 10%-ной взвеси эритроцитов смешивают с 0,2%-ным раствором акролеина, приготовленного на фосфатном буферном растворе (ФБР) с рН 7,2. Полученную суспензию выдерживают в течение 30 мин при 37°С, тщательно перемешивая, с последующим освобождением от акролеина многократным центрифугированием в течение 5 мин при 600-800g до полного исчезновения специфического запаха. Преимущество приготовленных таким образом эритроцитов заключается в том, что они заготавливаются впрок, могут длительное время сохраняться, не подвергаясь гемолизу.

В дальнейшем стабилизированные эритроциты в 10%-ной концентрации выдерживают при 2-4 °С в ФБР с рН 7,2 в течение двух месяцев.

Для повышения сорбционной способности и осаждаемости эритроцитов необходимо провести их танизацию путем смешивания равных частей 10%-ной суспензии отмытых эритроцитов и раствора танина на ФБР и рН 7,2 в разведении 1:30000. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 370 С в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от танина дважды в ФБР с рН 7,2 и трижды изотоническим раствором натрия хлорида с рН 7,2-7,4.

Оптимальным сроком гарантирующим получение качественных эритроцитарных диагностикумов является их сенсибилизация в течение 24- 48 часов после их обработки танином.

В процессе изготовления диагностикумов в качестве растворителя и консерванта используют 0,3%-ный фенолизированный изотонический раствор натрия хлорида с 0,1%-ной нормальной кроличьей или лошадиной сывороткой, предварительно инактивированной при 56°С в течение 30 мин и адсорбированной нормальными эритроцитами барана при 37°С в течение 30 мин.

Сенсибилизацию танизированных эритроцитов следует осуществлять гипериммунной сывороткой соответственно против рота- и коронавирусов крупного рогатого скота (производимой во Всероссийском НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко). При этом сенсибилизирующая доза (концентрация белка) антиротавирусной иммунной сыворотки составляет 280 мкг/мл, а иммунной сыворотки к коронавирусу -260 мкг/мл.

Сенсибилизацию проводят, смешивая равные объемы танизированных эритроцитов и предварительно прогретой в течение 30 мин при 560С иммунной сыворотки в оптимальной концентрации. Кроме того, вносят 3 части изотонического раствора натрия хлорида с рН 7,2 и 5 частей 0,1%-ного раствора хлорида хрома. Смесь, периодически помешивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. По истечении указанного времени смесь тщательно отмывают с использованием ФБР с рН 7,2, а затем приготовленные эритроцитарные диагностикумы ресуспендируют в консерванте до 1%-ной концентрации. Приготовленный диагностикум сохраняет свои основные качества в течение 8 мес., при условии хранения его при 4°С.

На всех этапах изготовления диагностикумов осуществляют контроль на самоагглютинацию. Специфичность приготовленных диагностикумов определяют путем постановки РНГА, где в качестве антигенов использовали стандартные диагностикумы вирусов ИРТ, ПГ - 3, аденовирусов, вирусной диареи, а также антигенов рота- и коронавирусов.

При постановке РНГА готовят последовательные двойные разведения исследуемого вируссодержащего материала (20-50%-ная суспензия проб фекалий), а затем в каждую лунку вносят равный объем эритроцитарного диагностикума. Плашки следует тщательно встряхнуть несколько раз, оставить при комнатной температуре до полного оседания эритроцитов в контроле. Показатель положительной реакции - агглютинация эритроцитарного диагностикума с интенсивностью агглютинации на 2+ в титре 1:4 и выше.

Реакция пассивной гемагглютинации)

метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы соответствующие специфические или антигены.

1. Малая медицинская энциклопедия. - М.: Медицинская энциклопедия. 1991-96 гг. 2. Первая медицинская помощь. - М.: Большая Российская Энциклопедия. 1994 г. 3. Энциклопедический словарь медицинских терминов. - М.: Советская энциклопедия. - 1982-1984 гг .

Смотреть что такое "Реакция непрямой гемагглютинации" в других словарях:

реакция непрямой гемагглютинации - РНГА Лабораторный тест с использованием эритроцитарных диагностикумов. [Англо русский глоссарий основных терминов по вакцинологии и иммунизации. Всемирная организация здравоохранения, 2009 г.] Тематики вакцинология, иммунизация Синонимы РНГА EN… … Справочник технического переводчика

- (РНГА; син. реакция пассивной гемагглютинации) метод обнаружения и идентификации антигенов или антител, основанный на возникающем в их присутствии феномене агглютинации эритроцитов, на поверхности которых были предварительно адсорбированы… … Большой медицинский словарь

- (РПГА) см. Реакция непрямой гемагглютинации … Большой медицинский словарь

Эта страница глоссарий. # А … Википедия

Основные сокращения, принятые в Ветеринарном энциклопедическом словаре - a., aa, artena, arteriae aa ana (поровну) АМН СССР Академия медицинских наук СССР АН СССР Академия наук СССР Bac. Bacillus Bact. Bacterium БССР Белорусская ССР в., вв. век, века v., vv. vena, venae ВАСХНИЛ Всесоюзная ордена Ленина и… …

У этого термина существуют и другие значения, см. Чумка. Чума плотоядных (болезнь Каре) острая или подострая контагиозная вирусная болезнь, проявляющаяся лихорадкой, катаральным воспалением слизистых оболочек, поражениями кожи, центральной… … Википедия

- (renes) парный экскреторный и инкреторный орган, выполняющий посредством функции мочеобразования регуляцию химического гомеостаза организма. АНАТОМО ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ ОЧЕРК Почки расположены в забрюшинном пространстве (Забрюшинное пространство) на… … Медицинская энциклопедия

I (trichinellosis; синоним: трихиноз, «одутловатка») гельминтоз из группы нематодозов, характеризующийся лихорадкой, миалгиями, отеком лица, кожными сыпями, эозинофилией крови, а при тяжелом течении поражением внутренних органов и центральной… … Медицинская энциклопедия

- (nematodoses) гельминтозы, вызываемые нематодами круглыми червями класса Nematoda. Среди других гельминтозов Н. имеют наибольшее значение в патологии человека, большинство из них геогельминтозы (см. Гельминтозы); развитие их яиц или личиночных… … Медицинская энциклопедия

эпидидимит инфекционный - Рис. 1. Увеличение левого семенника у барана при эпидидимите инфекционном. Рис. 1. Увеличение левого семенника у барана при эпидидимите инфекционном. эпидидимит инфекционный баранов (Epididymitis infectiosa arietum), хроническая инфекционная… … Ветеринарный энциклопедический словарь

См. Реакция непрямой гемагглютинации … Большой медицинский словарь

Реакцию проводят для обнаружения антигенов возбудителей в исследуемом материале, добавляя в нему иммунную сыворотку. При наличии гомологичного антигена происходит связывание антител, поэтому после добавления сенсибилизированных антигеном эритроцитов их агглютинации не происходит, что оценивается как положительный результат. Для большей чувствительности реакции специфическую иммунную сыворотку добавляют к исследуемому материалу в минимальном количестве (2 гемагглютинирующие единицы). Титр иммунной сыворотки определяют предварительно с помощью РНГА. За одну гемагглютинирующую единицу принимают предельное разведение сыворотки, которое вызывает склеивание эритроцитов.

Методика. В лунки полистироловых пластин или агглютинационные пробирки вносят по 0,025 мл 1% раствора нормальной сыворотки кролика и делают серийные 2-кратные разведения исследуемого материала. Затем во все лунки добавляют по 0,025 мл имунной сыворотки, пластинку встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 37ºС или на 1 ч при комнатной температуре. Далее во все лунки добавляют по 0,025 мл антигенного диагностикума, встряхивают и оставляют на 2 ч, после чего учитывают результаты.

При проведении этой реакции к контролю для РНГА добавляют контроль специфичности иммунной сыворотки, состоящий из специфического антигена, иммунной сыворотки (2, 1, 0,5 гемагглютинирующей единицы) и взвеси сенсибилизированных эритроцитов.

РТНГА применяют также для обнаружения специфических антител (полных и блокирующих), для чего к исследуемой сыворотке добавляют дозированное количество антигена. Если в ней содержатся антитела, то происходит связывание их антигеном, поэтому после добавления эритроцитов, сенсибилизированных антителами (2-й этап РТНГА), склеивания эритроцитов не происходит.

Благодаря использованию минимального количества антигена (2 нейтрализующие дозы) реакция высокочувствительна. Количество нейтрализующих доз в антигенном препарате определяют с помощью РНГА, при этом делают серийные 2-кратные разведения антигена в 1 % растворе нормальной сыворотки кролика и в лунки вносят антительный эритроцитарный диагностикум. Нейтрализующей дозой антигена считают его максимальное разведение, дающее полное склеивание сенсибилизированных эритроцитов.

Перед проведением реакции испытуемые сыворотки разводят 1:5-1:10 и инактивируют при температуре 56°С в течение 30 мин. Для адсорбции гемагглютининов к сывороткам добавляют 50 % взвесь формалинизированных или свежих отмытых эритроцитов барана из расчета 0,1 мл взвеси на 1 мл разведенной сыворотки. Смесь встряхивают и инкубируют 30 мин при температуре 37ºС или 1 ч при комнатной температуре, после чего эритроциты осаждают центрифугированием. Можно для осаждения эритроцитов оставить сыворотки в холодильнике до следующего дня.

При проведении опыта исследуемый материал разводят в 1 % растворе нормальной сыворотки кролика в объеме 0,025 мл в лунках панели микротитратора. Затем в каждую лунку добавляют по 2 нейтрализующих дозы антигена в объеме 0,025 мл. Пластины встряхивают и оставляют на 30 мин при температуре 37 °С или на 1 ч при комнатной температуре. Затем во все лунки вносят по 0,025 мл антительного эритроцитарного диагностикума. Пластины встряхивают и инкубируют 1,5-2 ч при комнатной температуре, после чего учитывают результаты реакции. Учет можно производить также и на следующий день. Титром исследуемой сыворотки считают максимальное разведение ее, в котором не происходит склеивания эритроцитов.

Опыт сопровождают следующими видами контроля:

1) стабильности сенсибилизированных эритроцитов (эритроциты +1 % раствор нормальной сыворотки кролика);

2) полноты истощения гемагглютининов в каждой испытуемой сыворотке (испытуемая сыворотка в наименьшем разведении + формалинизированные эритроциты);

3) правильности определения минимальной нейтрализующей дозы антигена (2, 1 и 0,5 нейтрализующей дозы антигена + антительный эритроцитарный диагностикум).

Реакция обратной непрямой гемагглютинации (ронга) применяется для индикации бактериальных и вирусных антигенов в исследуемых материалах, а также для экспресс-диагностики ряда инфекций.

В отличие от РНГА при данной реакции эритроциты сенсибилизируют не антигеном, а антителами, агглютинация которых происходит при добавлении антигена.

Эритроциты предварительно фиксируют формалином, или глютаральдегидом, а затем связывают их с гамма-глобулином, который выделяют из иммунных сывороток и очищают от других сывороточных белков. Связывание гамма-глобулина с поверхностью эритроцитов происходит с помощью хлорида хрома. Для этого к 8 объемам дистиллированной воды добавляют 1 объем иммуноглобулинов, выделенных из иммунной сыворотки, 1 объем 50 % взвеси формалинизированных эритроцитов и 1 объем 0,1-0,2 % раствора хлорида хрома. Смесь оставляют на 10-15 мин при комнатной температуре, затем обрабатывают эритроциты как при реакции пассивной гемагглютинации.

Специфичность антительного диагностикума проверяют в реакции торможения пассивной гемагглютииации гомологичным антигеном. Реакция должна тормозиться гомологичным антигеном не менее чем в 16 раз и не тормозиться гетерологичным. Используется контроль на отсутствие спонтанной гемагглютинации.

С помощью этой реакции проводят индикацию возбудителей в материале, взятом из органов погибших людей и животных, например, из мозга, селезенки, печени легких. Готовят 10 % суспензию указанных органов на изотоническом растворе натрия хлорида, центрифугируют их в течение 30-60 мин при 10000 об/мин и используют надосадочную жидкость в качестве антигена.

Методика. Готовят 2-кратные разведения исследуемого материала (антигена) на стабилизирующем растворе. Вносят по 1 капле каждого разведения антигена в 3 соседние лунки микропанели (реакция занимает 3 параллельных ряда лунок). В каждую лунку первого ряда добавляют по 1 капле стабилизирующего раствора, в лунки второго ряда – по 1 капле гомологичной иммунной сыворотки в разведении 1: 10, третьего ряда – по 1 капле гетерологичной иммунной сыворотки. Второй и третий ряды служат контролями специфичности реакции. Смесь оставляют на 20 мин при комнатной температуре.

Во все лунки добавляют по 1 капле 1 % суспензии сенсибилизированных эритроцитов (эритроцитарный антительный диагностикум) и тщательно встряхивают пластины. Результаты реакции учитывают через 30-40 мин. При наличии специфического антигена гемагглютинация отмечается в первом и третьем ряду (с гетерологичной сывороткой) и отсутствует во втором ряду, где антиген предварительно нейтрализован гомологичной сывороткой.

Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на спонтанную агглютинацию.

Реакция торможения обратной непрямой гемагглютинации (РТОНГА) позволяет определить наличие антител в сыворотках людей и животных.

Методика. Сыворотки разводят в 10 раз изотоническим раствором натрия хлорида, прогревают 20 мин при температуре 65 °С для разрушения неспецифических ингибиторов, а затем готовят 2-кратные разведения сывороток на стабилизирующем растворе и рабочую дозу антигена, содержащую 4 агглютинирующие единицы. Вносят по 1 капле каждого разведения сыворотки в лунки микропанели и добавляют в них по 1 капле антигена, разведение которого соответствует рабочей дозе. После контакта компонентов смеси в течение 20 мин при комнатной температуре во все лунки вносят по 1 капле эритроцитарного антительного диагностикума и тщательно встряхивают. Через 1,5-2 ч инкубации при комнатной температуре по гемагглютинации учитывают результаты реакции. Титром сыворотки является ее наибольшее разведение, которое полностью тормозит реакцию гемагглютинации с четырьмя агглютинирующими единицами антигена.

Реакцию сопровождают контролями сенсибилизированных эритроцитов на спонтанную агглютинацию в присутствии: а) стабилизирующего раствора; б) нормального антигена (из материала, не содержащего вирус); в) исследуемой сыворотки. Преимущество реакции заключается в ее универсальности и возможности использования для выявления различных антигенов.

Оценка результатов гемагглютинации. Результаты РНГА, РОНГА и РТОНГА учитывают по степени агглютинации эритроцитов: (++++) – полная агглютинация; (+++) – менее полная агглютинация; (++) – частичная агглютинация; (+) – следы агглютинации; (–) – отсутствие агглютинации.

Реакция считается положительной, если агглютинация полная (++++) или почти полная (+++), диагностикум не дает спонтанной агглютинации в присутствии каждого компонента реакции и контроль специфичности антигена или антитела положительный.